質粒圖譜

質粒圖譜為質粒DNA序列的物理圖譜，提供了包括質粒的大小、篩選標記、克隆位點、轉錄及翻譯元件等信息，為我們選擇質粒、了解質粒特點及應用提供了重 要依據。對于初學者來說該如何去閱讀質粒圖譜呢？今天來給大家講解一下如何閱讀質粒圖譜及構建質粒圖譜。

質粒的組成要素有哪些

1. 復制起始位點：Ori即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
   

2. 抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+。

3. 多克隆位點MCS：克隆攜帶外源基因片段。

4. P/E 啟動子/增強子

5. Terms 終止信號

6. 加poly（A）信號：可以起到穩定mRNA作用

如何閱讀質粒圖譜

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）。

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

1.Ampr 水解 β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。

2.tetr 可以阻止四環素進入細胞。

3.camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

4.neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418（卡那霉素衍生物衍生物）失活。

5.hygr 使潮霉素 β 失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。

它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。

質粒一般只能容納小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。

這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用哪種載體，還是要以實驗目的為準繩。

啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號

啟動子－促進 DNA 轉錄的 DNA 順序，這個 DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。

增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。

核糖體結合位點/起始密碼/ SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。

第六步：質粒圖譜上的箭頭。

 有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質粒是環狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

質粒構建以及需要注意的事項：

1.載體構建

 載體構建(vectorconstruction)：載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點（MCS）的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。

 特點：當給質粒插入一段外源DNA片段后，它依然能夠進行自我復制。

2.多克隆位點

 多克隆位點（multiple cloning site, MCS），指的是包含數個（最多20個）限制性酶切位點（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位，每個限制性酶切位點通常是十分奇特的，即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進行酶切的位點，多克隆位點一般是位于質粒上的一段序列，這段序列含有很多個酶切位點，但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

3.質粒構建

（1）質粒構建原理

質粒構建是分子生物學研究中經常使用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后，將二者連接在一起，再導入宿主細胞，實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。

（2）質粒構建方式

質粒構建方式多樣，常規的T4連接酶，下面就介紹下T4連接酶構建質粒方法，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接，但一般推薦適用黏性末端。

（3）質粒載體的制備

質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

圖 質粒圖譜

4.一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

   （1）選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太小（>10bp），否則影響限制性內切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切；

    （2）一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

（3）實驗后繼應用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點）。

（4）盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

（5）兩個酶切點至少隔上3個堿基。

（6）兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。

（7）最好使用酶切效率高的酶。

（8）最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

注：質粒構建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。

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