瓊脂糖凝膠電泳的實驗步驟及常見問題分析

實驗原理：

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。

實驗步驟：

1. 配膠 首先根據(jù)DNA片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度，稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖粉末于TAE/TBE緩沖液中溶解，微波加熱1min左右取出（時間根據(jù)體積改變），加入Gelred染料，搖晃均勻后倒入模具。

注：緩沖液為三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）或三硼酸-EDTA（TBE），三酸溶液是微堿性條件下的有效緩沖液，可保持DNA去質(zhì)子化并溶于水。EDTA是一種螯合劑，能使可能損害被分析的DNA的核酸酶失活。

表1 DNA片段大小與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系

2、凝膠澆注

選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳齒。輕柔地將加了染料的瓊脂糖凝膠溶液倒入模具中，觀察有無氣泡產(chǎn)生，在膠未全部凝固的時候戳破，否則會影響最終結(jié)果。注：速度不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。

3、將樣品與DNA loading buffer混合

將樣品與含溴酚藍的loading buffer混合，loading buffer可以幫助我們觀察樣品的位置。

4、凝膠裝入

待膠變硬，直到呈乳白色且不透明（約20-30 min），小心地垂直拔出梳齒，將膠塊放入電泳槽中，確保孔位于負電極（一般為黑色），將運行緩沖液（TAE或TBE）注入槽中，使凝膠被淹沒1-2 mm。用移液器向泳道中加樣，不要超過泳道載量，否則樣品會溢出。

5、凝膠運行

確保電極沒有插反，否則樣品會跑到緩沖液中。設(shè)定凝膠運行的時間和電壓，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，DNA從負極移到正極，電泳時間30-60 min，具體根據(jù)凝膠比例和片段大小進行調(diào)整（一般120V，35 min即可）。電泳結(jié)束后，拔掉電源。

常見問題分析：

1.加樣孔有熒光

（1）提DNA時有蛋白質(zhì)殘留。

（2）基因組DNA，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。

2.條帶扭曲呈波浪狀

（1）配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時配制的。

（2）電泳時電壓過高。可以在電泳前15分鐘用較低電壓（3 V/cm），等條帶出孔后，再調(diào)電壓。

（3）慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。

3.條帶彌散

（1）DNA發(fā)生降解。

（2）電泳緩沖液陳舊（根據(jù)DNA Maker對照，觀察是否為電泳體系的問題）。

（3）PCR過程產(chǎn)生非特異性的擴增 （使用特異性較高的引物）。

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