大鼠肝細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)

材料與儀器

L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液 Ham F12 培養(yǎng)液 胞培養(yǎng)液 HMM SF 無(wú)鈣 HEPES 緩沖液 膠原蛋白酶液 5% 戊芭比妥鈉 肝素
聚乙稀管 一次性 20 G 頭皮靜脈輸液針 縫合線(xiàn) l 注射器 水浴箱 蝠動(dòng)泵

步驟

一、材料

1. 無(wú)菌

（1）L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液

（2）Ham F12 培養(yǎng)液或 WilliamE 培養(yǎng)液：80～100 ml，含有 0.2% 牛白蛋白（V 級(jí)，Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰島素

（3）胞培養(yǎng)液（hepatocyte minimalmediu，HMM )：67.5% EMEM 和 22.5%199 培養(yǎng)液，或用 William E 培養(yǎng)液代替這兩種培養(yǎng)液。添加 5ug/ml 牛胰島素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸鈉、100U/ml 青霉素、100 Mg/ml 鏈霉素和 20%FBS

（4）HMM/SF：無(wú)血清 HMM ，添加 10-5mol/L 氫化可的（木公）半琥珀酸酯

（5）無(wú)鈣 HEPES 緩沖液：含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO4·12 H2O 和 33 mmol/L HEPES，pH 7.65。用 0.22, 又微孔濾器過(guò)濾除菌，在 4℃ 條件下儲(chǔ)存，可存放 2 個(gè)月

（6）膠原蛋白酶液：含有 0.025% 膠原蛋白酶（I 級(jí)，Sigma; 或 Boche，103578) 和 0.075% CaCl2·2 H2O，用 pH 7.65 的無(wú)鈣 HEPES 緩沖液配制。使用前配制，并用濾器過(guò)濾除菌

（7）5% 戊芭比妥鈉（Abbott)

（8）肝素（Roche)

（9）聚乙稀管：內(nèi)徑為 3 mm ，外徑 5 mm

（10）一次性 20 G 頭皮靜脈輸液針（Dubernard Hospital Laboratory，Bordeaux，F(xiàn)rance)

（11）插管用的縫合線(xiàn)

（12）刻度瓶和 Petri 培養(yǎng)皿

（13）手術(shù)器械：尖剪、直剪、彎剪和手術(shù)夾

（14）2 支二次性 1 ml 注射器

2. 非滅菌

（1）計(jì)時(shí)器

（2）蝠動(dòng)泵：10～200r/min

（3）水浴箱

二、操作步驟

1. 用水浴箱將 HEPES 緩沖洗液和膠原蛋白酶液預(yù)熱，一般 38～39℃，進(jìn)人肝內(nèi)時(shí)為 37℃。不需要加氧。

2. 將螺動(dòng)架的流速設(shè)定在 30 ml/min。

3. 腹膜腔注射戊芭比妥鈉（每 100 g 體重注射 150ul)，將大鼠（180～200 g ) 麻醉。然后，經(jīng)股靜脈注射 10001U 肝索。

4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹側(cè)面。

5. 切開(kāi)腹壁，在離肝約 5 mm 處將結(jié)扎線(xiàn)系于肝門(mén)靜脈上。朝肝的方向插管后，結(jié)扎肝門(mén)靜脈。

6. 為了避免壓力過(guò)高，迅速剪開(kāi)肝靜脈。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 無(wú)鈣 HEPES 緩沖液。幾秒鐘內(nèi)確認(rèn)肝變白。

7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 膠原蛋白酶液。肝變得腫脹。

8. 切除肝，用 HEPES 緩沖液沖洗。

9. 剝離 Glisson 囊后，用 100 ml L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液分散細(xì)胞。

10. 用兩層紗布或孔徑為 60～80um 的尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。通常在室溫條件下，讓有活力的細(xì)胞沉淀 20 min 。然后，吸去 60 ml 含有細(xì)胞碎片和死細(xì)胞的上清液。

11. 通過(guò)緩慢離心（50 g，40s) 洗細(xì)胞 3 次，以除去膠原蛋白酶、損傷細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞。

12. 用 HMM 混懸分離的肝細(xì)胞。

13.2～3 h 后，活細(xì)胞會(huì)貼壁，并開(kāi)始伸展。吸去含有死細(xì)胞的上清液。

14. 細(xì)胞貼壁后，用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后，每天換培養(yǎng)液。