蛋白質(zhì)合成實(shí)驗(yàn)

材料

無(wú)菌

細(xì)胞培養(yǎng)，如 1X104～ 1X106 個(gè)細(xì)胞，24 孔板
3H-亮氨酸。無(wú)血淸培養(yǎng)基中 2 MBq /ml (～50uCi/ml) (特異活性并不重要，因?yàn)樗鼘⒂膳囵B(yǎng)基中的亮氨酸濃度決定）

非無(wú)菌

SLS 或 SDS，1% (35m mol/L ) 溶于 0 .3 mol/L NaOH
三氯醋酸（TCA)
液閃瓶
Eppendorf 管
閃爍液，最小含水為 10%

操作步驟

1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至所需密度。

2. 從孵箱中取出培養(yǎng)板，加人預(yù)溫的溶于培養(yǎng)液或 BSS 中的放射性同位素，稀釋度為 1:10 (如 l00ul/ml/孔）。

3. 盡快地將細(xì)胞放回孵箱。

4 . 繼續(xù)培養(yǎng) 4～24 h。

提示： 不同的蛋白質(zhì)更新率不盡相同。本操作程序并不針對(duì)任何特定的一種蛋白質(zhì)，而可用于快速生長(zhǎng)細(xì)胞中的總蛋白。當(dāng)?shù)谝淮斡脕?lái)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞系的蛋白質(zhì)合成時(shí)，要核實(shí)合成率在所選的孵育時(shí)間內(nèi)是否呈線性。如果氨基酸池比飽和時(shí)低，可發(fā)生延遲。

5 . 從孵箱中取出培養(yǎng)物，小心從孔中吸去培養(yǎng)液至適當(dāng)?shù)膹U棄放射性液體容器中（見(jiàn) 7.7.2 節(jié)）。
1. 用冷 HBSS 或 D-PBSA 輕輕地清洗細(xì)胞。

提示 某些單層培養(yǎng)，特別是一些松散貼附的連續(xù)細(xì)胞系，諸如 HeLa-S , 可能在清洗時(shí)便離散開(kāi)來(lái)。如遇這種情況，移去同位素，并加入甲醇，將單層固定，靜止 lO min，小心地移走甲醇，令其晾干。

7．將培養(yǎng)板置于冰上，加人 0.6mol/L TCA ，于 4°C 靜置 lO min ，：然后吸去所有未摻入的前體物。

8. 重復(fù)第七步 2 次，但每次只許 5 min 。

9 . 以 MeOH 清洗培養(yǎng)物，晾干培養(yǎng)板。

10．加人 0.5 ml 0.3mol/L NaOH ，內(nèi)含 1% SLS，室溫下靜置 30 min 。

11. 混合每孔中的培養(yǎng)物，將它們移人液閃瓶中。

12. 加入 5m l 閃爍液，在閃爍儀中計(jì)數(shù)。

提示： 生物降解性閃爍劑（如 Ecoscint)，比以甲苯或二甲苯為基礎(chǔ)的閃爍液更好，因?yàn)橹灰欠派浠钚缘陀谝?guī)定量，前者毒性較小，可以與大量的水一起倒入水池 中。對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，在第 5 步用 1000 g 離心 l0 min ，去除培養(yǎng)基，除了第 9 步外 6，7 ，8 也須重復(fù)此步驟，第 9 步的培養(yǎng)板也可在磷光成像儀（phosphorimager) 上直接定量測(cè)定。