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    DNA提取的8個問題解答

    發布時間: 2021-09-28  點擊次數: 8205次

    質粒DNA的提取是DNA技術中的必需實驗技能。分離質粒DNA一般分為三個步驟:

    1、培養細菌使質粒擴增

    2、收集和裂解細菌

    3、分離和純化質粒


    DNA堿裂解法是較常用的提取的方法,在質粒提取過程中,由于機械力、酸堿度、試劑等的原因,可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以,多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒:共價閉合環狀DNA(cccDNA):質粒的兩條鏈沒有斷裂;超螺旋開環DNA(ocDNA)


    而在DNA提取中總會遇到各種一些問題,導致實驗無從下手,下面我們來分析一些常見的問題:

    一、為什么用無水乙醇沉淀DNA?

    乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,當加入乙醇時,乙醇會奪DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般實驗的做法是:初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。


    二、在用無水乙醇沉淀DNA時,為什么一定要加NaAC或NaCL至最終濃度達0.1-0.25MOL/L?

    在Ph為8左右的DNA溶液中,DNA分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時,DNA沉淀不*,反之DNA難以收集。在沉淀的DNA過程中,由于過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀。


    三、為什么在保存或抽提DNA過程中,一般采用TE緩沖液?

    在基因操作實驗中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用,所以采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH /Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。加核糖核酸酶降解核糖核酸后,要用SDS與Kac來處理一次,可以讓沉淀更加*。


    四、如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來沉淀DNA?

    采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,而小分子所需PEG濃度在20%左右


    五、為什么用酚與氯仿抽提DNA時,還要加少量的異戌醇?

    在抽提DNA時,為了混合均勻,必須劇烈振蕩容光煥發器數次,加入異戌醇能降低分子表面張力,減少在振蕩時氣泡的產生;配比一般是氯仿與異戌醇為24:1,也可以采用酚,抽提DNA去除蛋白質時,由于酚與氯仿是互溶的,可用氯仿第二次變性蛋白質,此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時,將酚與氯仿混合(1:1)使用


    六、為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?

    因為酚與水有一定的互溶。苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失。用Tris調節至PH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。


    七、呈粉紅色的酚可以使用嗎?

    保存在冰箱中的酚,容易和空氣中的氧氣發生化學反應而變成粉紅色的,這樣的酚容易降解DNA,一般不可以使用


    八、怎么保存酚不被空氣氧化?

    加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%。8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末,不僅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚,最好分裝在棕色小試劑瓶里,上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液,隔絕空氣,也可以往瓶里充入氮氣,防止與空氣接觸而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中,可以保存幾個月不會變色。


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