細(xì)胞培養(yǎng)之“麻煩精”支原體的防治方法

支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，。因支原體屬于直徑介于0.2-2µm的最小原核生物，形態(tài)易變，所以即使用濾網(wǎng)給培養(yǎng)基過濾20次，它還會在已經(jīng)感染的培養(yǎng)基中“陰魂不散"，而又因?yàn)樗鄙偌?xì)胞壁，沒有這層外衣包裹之后的它，可以成功逃過大部分抗生素的“追殺"。在細(xì)胞培養(yǎng)液中，支原體可達(dá)到107-108CFU/mL（CFU=Colony Forming Unit，是一種支原體的濃度測量單位）而不使培養(yǎng)液混濁及影響細(xì)胞生長，而因?yàn)樵诔醺腥緯r(shí)它不會給細(xì)胞帶來任何影響，這一點(diǎn)，估計(jì)黑膠蟲都要被它隱蔽得方式折服。

那么支原體污染對細(xì)胞有什么影響呢？

1.支原體污染導(dǎo)致細(xì)胞收縮，貼壁細(xì)胞脫落裂解，細(xì)胞空泡化。。。

2.引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA 的合成障礙；

3.使培養(yǎng)基成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細(xì)胞代謝

4.破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞信號傳遞；

5.引起細(xì)胞的染色體異常；

6.使惡性細(xì)胞致癌能力下降、影響淋巴細(xì)胞分化以及細(xì)胞中病毒的產(chǎn)量。

支原體污染有哪些檢測方法？

1.相差顯微鏡檢測；

2.低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察；

3.DNA熒光染色法；

4.電鏡檢測；

5.3-H胸腺嘧啶摻入法；

6.聚合酶鏈反映法；

7.免疫學(xué)方法；

8.支原體的培養(yǎng)。

支原體污染的補(bǔ)救的方法：

1.抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對于支原體污染抗生素應(yīng)用，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好。

2 . 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用5-10小時(shí)可以殺滅支原體。但由于41度對培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大的影響，故處理前，應(yīng)*行預(yù)試驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。

3.裸鼠過繼法：將支原體污染的細(xì)胞用0,25%胰酶,0.02%EDTA消化制成單細(xì)胞懸液后用PBS洗滌離心2次,調(diào)細(xì)胞密度至10^7 /ml;經(jīng)小鼠背部皮下接種0.2ml細(xì)胞約10~15天后即可形成移植瘤;3~4周后無菌條件下取出移植瘤組織,剔除壞死部分,用注射器針芯在200目篩下將組織壓碎使細(xì)胞釋放入含0.1%EDTA的無血清DMEM培養(yǎng)液中:將細(xì)胞懸液小心加入含有淋巴細(xì)胞分離液離心管上層,室溫下水平離心 3000r/min,20min;用吸管吸出兩種液體界面層的細(xì)胞，置無血清DMEM培養(yǎng)液中,再用無血清DMEM將細(xì)胞洗滌離心1次,用*培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。