如何在WB中順利獲取大分子蛋白？

分子量大于 150Ka 的蛋白，經常折磨我們實驗人。想當初，辛辛苦苦忙到深夜，結果發現顯影空空如也。連續幾個月如此，內心是何等抓狂。當大分子條帶第一次出來的時候，心里特別開心，就像見到了初戀情人一樣。看到周圍有同仁受困于大分子蛋白，想一想當初所面對的困境。 

在此,分享一下大分子蛋白的心得，希望這些經驗對那些與大分子蛋白奮戰的童鞋提供幫助。 

提蛋白時應加入 RIPA 強效裂解液，在 4℃環境下靜置的時間延長十分鐘到二十分鐘。這樣可以充分裂解大分子蛋白（裂解不充分，大分子蛋白的電泳速度會很慢）。電泳時，電泳的時間要足夠長。

電泳全程采用 120-150V 的高電壓，使 Marker 拉開足夠大的距離。電泳時要在冰水浴中進行。 

轉膜時，濕轉法與半干轉法均可以（濕轉法獲得條帶漂亮。半干轉轉膜效率高），轉膜時，要保留分離膠（好多分子量超過 250KDa 的蛋白就殘留在濃縮膠中！這是血的教訓！當初好 幾次傻傻的把濃縮膠扔了，結果神馬條帶都沒有！）。

先說濕轉法，轉膜緩沖液中甲醇濃度最高 10%，加入 SDS，使 SDS 終濃度達到 5%（大于 300KDa 的蛋白，轉膜液中 SDS 的終濃度可以到 10%)。以下摸索出來濕轉法的轉膜時間（曾經試驗過 30mA 小電流轉膜過夜的方法，PVDF 膜上神馬都沒有。建議大家不要嘗試！）。

用半干轉時轉膜效率高。恒壓模式設置為 40V 電壓，轉膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能轉到 PVDF 膜上。 

或者用恒流法轉，電流大小設置為 PVDF 膜的面積，轉一個小時左右就可以出來。若怕轉膜過頭，可以將兩張 PVDF 膜重疊起來（總會有一張膜上有條帶）。 

因為多數大分子蛋白是膜蛋白，表達較少，建議延長一抗孵育時間。有一次甚至孵育了四天才出結果。大分子蛋白與 PVDF 膜的結合不是很牢固，容易脫落，因此在洗膜時要操作輕柔，不要過于粗暴，否則抗原抗體復合物容易脫落。 

這些經驗是從幾百次失敗的實驗中總結出來的，希望對大家有所幫助。實驗失敗不可怕， 重要的是要勇于面對，仔細思考，敢于改進。

最后，祝大家實驗順利，早出漂亮結果！