分析為何細胞狀態差

細胞狀態很差，常常出現的現象是：細胞邊緣不清晰、細胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點很多、細胞碎片多（細胞凋亡后的細胞碎片）、單個細胞內有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細胞出現老化，也就是細胞比較扁平、增殖減緩、細胞核體積增大、細胞突觸變多，此時觀察到的細胞狀態也是不正常的。

▲ 圖1：背景很臟；

▲圖2：有較多小黑點

因此細胞狀態差只是對這些現象的一種籠統說法。

究其根本，細胞狀態變差主要是由于兩種原因：

1 細胞營養條件不夠

2 細胞被污染了

今天我們將深入分析影響細胞狀態的這些原因。

一、營養條件不夠

細胞營養條件不夠時，就需要從培養基方面考慮。

（1）血清

由于血清來源于動物，且含有細胞培養中所需的各種營養（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等），這奠定了血清是細胞培養實驗中最基礎普遍的試劑的基礎。

市面上的牛血清產品名稱雖然五花八門，但根據其不同的特性，追其根本，大致可分為以下四種。根據牛的取血年齡可以區分：

胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡稱FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心臟穿刺采血得來的血清。

國產胎牛血清（并無明確定義，但通常用此命名）指的是出生4-6小時，且未進行哺乳（unsuckled）進食的新生牛，有時還稱作國產新生牛血清。 

新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡稱NBCS，或稱小牛血清）指的是出生14天-3個月進行取血的牛血清。

成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡稱ABS）指的是取血時牛齡通常超過12個月的牛血清。

以上取血牛齡的差異主要是受當地國家畜牧業的發展及法規限制影響，因為牛血多為畜牧業副產業，并未有專門為取血而養的牛。

這幾種不同牛齡血清所含的促細胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質等組分與比例不同。常規來說，牛齡越小的牛血清，細胞培養效果越好。但是也需要根據自己培養的細胞類型來選擇最合適的血清。

同一血清不同批號內的成分和營養組成比例會不同，因為血清來源于動物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。每個批號的組分和百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。因此在實驗過程中，需要經過測試來找尋合適的血清批次。當實驗需要更換血清時，細胞需要有一段適應期。因此，要根據自己的細胞種類進行合適的選擇。

（2）基礎培養基

培養細胞時，除了血清還需要添加基礎培養基，混合成為*培養基，基礎培養基是成分確定且知其確切含量的，可以補充血清中缺乏的營養元素，基礎培養基一般含有氨基酸、無機鹽、維生素、含碳物質，蛋白和其他營養元素，每種成分對于細胞存活、代謝等功能都有不同影響，不同細胞系需要的成分含量也不同，因此市面上會存在各類培養基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基礎培養基也需要根據自己培養的細胞種類進行更合適的選擇。自行配制基礎培養基時，需要注意是否需另外添加營養物或必需物至培養基中（如：碳酸氫鈉）并調整pH值。使用不適合的培養基培養細胞，細胞仍可生長但特性會改變。培養基中常用的酚紅（pH指示劑）本身有微弱雌激素作用，會刺激具有雌激素受器的細胞生長。

如果您都是按照操規范保存培養基和培養細胞，那么我們繼續考慮污染情況。

二、細胞被污染

污染情況通常從以下幾部分考慮。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、細菌、支原體、黑膠蟲、病毒、細胞交叉污染等。

這些污染都是有其自有特征的噢~

（1）真菌污染

這類微生物外觀類似棉絮狀的漂浮物，在顯微鏡下可觀察到菌絲體，污染早期不會使培養基變黃。

（2）酵母菌污染

顯微鏡下常見成串的珠狀物形態呈卵形，大約比細胞小5~10倍，當其進行出芽生殖時，會聚集成連體結構；爆發污染嚴重時，會造成培養基pH值改變，不易除去。

（3）細菌污染

培養基在短時間內變成黃色或白色渾濁，細胞停止生長甚至死亡；有些狀況下培養基顏色改變不明顯但細胞形態會變異（出現多角，多核狀況）、細胞不附著，顯微鏡觀察背景有大量黑點。

（4）支原體污染

支原體種類較多，常以寄生或腐生營養方式生長，廣泛存在于環境之中，是細胞培養過程常見污染，經常來源于實驗人員（支原體常見于人體皮膚、呼吸道、生殖道和消化道）、動物源血清及胰酶、消毒不*的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通過一般標準的細胞培養過濾方法，0.22μm過濾膜。支原體增長速度相較于細菌比較緩慢，污染初期（輕微）培養基可能依然清澈不會變黃，所以輕微污染時不容易用常規方法發現（細胞外觀觀察或是DNA染色法）確認。

▲ 左圖：感染前；                                                ▲ 右圖：感染后

支原體污染不但會緩慢改變細胞形態、增殖、基因表達、蛋白合成及代謝反應，它攜帶的DNA/RNA與蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌體實驗結果偏差。

（5）黑膠蟲污染

目前科學界對黑膠蟲并無定論，認為是不明沉淀現象或多種未知生物污染現象的通稱。在高倍率顯微鏡頭下，可觀察到各式形狀的小黑點（卵圓狀、球狀、桿狀等）、活躍的布朗運動及明顯游動現象，部分黑膠蟲具有細胞毒性，可引起細胞生長遲緩或裂解凋亡。

▲ 黑膠蟲污染

（6）病毒污染

病毒感染可能來自宿主動物細胞或病人，病毒感染及傳播具有細胞專一性，在細胞培養污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態變形，嚴重時會在單層細胞上觀察到局部破損空斑。

▲ 左圖：Before infection；右圖：After 24 hours infectiond

（7）細胞交叉污染

曾有文獻報道統計，目前使用的細胞株大約有15~20%不是科學家們所認為的細胞，而在生物醫藥領域中，細胞來源和細胞株身份鑒定檢測觀念普遍缺乏。細胞株的交叉污染，常在不經意的實驗疏失（不同細胞株分盤時，共享一瓶培養基、槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細胞株之間的混合污染，或是實驗操作人員錄入錯誤細胞株名稱，繼代時的培養皿，冷凍細胞時的凍存管）中發生，而造成錯誤后續數據搜集；目前大部分的科學期刊都已有“細胞相關實驗論文發表前，均需附上細胞鑒定報告”的規定（可查閱：文章發表前要求提供細胞鑒定的雜志），以此保證數據來源的正確性。

目前常用的細胞身份驗證的方式包括：短串聯重復序列（STR）、同功酶分析、染色體組分型、擴增片段長度多態性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前國際細胞庫（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于細胞株身份鑒定方法。

三、細胞老化了

無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養過程中細胞老化現象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質中出現空泡等現象。

老化細胞不會立即死亡，但其基因表達會發生變化，如果細胞老化現象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復蘇細胞。

圖1： 實心箭頭指示的是發生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽性，而空心箭頭指的是未發生老化的細胞。

圖2： 被染上藍色的是發生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發生老化的細胞。

由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。

分析了這么多~

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