1.前言

在分子克隆實驗中，感受態細胞轉化是基因克隆的基礎步驟之一。但相信很多同學在涂板后，常常會出現平板上菌落稀少甚至“空空如也"的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實驗進度，還會消耗寶貴的試劑和時間。實驗為何會卡在這一步？本篇文章，將從幾個關鍵環節入手，一起和大家好好探討一下這個問題。

2.感受態細胞“不給力"

感受態細胞的轉化效率直接決定了實驗成敗。如果細胞本身質量不佳，后續操作再完好也無濟于事。例如感受態細胞經常反復凍融或長期儲存（超過6個月），則很有可能會導致其活性顯著下降。

感受態細胞是非常脆弱的，一些操作上的失誤同樣會嚴重影響轉化效率，凍融過程中如果未將細胞置于冰上，則可能會破壞細胞膜的脆弱結構；解凍后若未及時使用（如放置超過10分鐘），細胞活性會快速下降；加入質粒后劇烈吹打也會破壞細胞膜，進一步降低轉化成功率。正確的操作應該是：凍融時需全程冰上操作，解凍后立即進行轉化反應，質粒加入后僅需輕彈混勻。

3 質粒“用量"不當或與宿主菌不兼容

質粒是轉化成功的核心，但它的用量常被忽視。在感受態細胞轉化實驗中，質粒的用量需通過質量（ng） 而非體積（μL）去控制。

若僅依賴體積添加，就可能會因為質粒濃度差異導致實際用量超出合理范圍（通常建議是 50-100 ng），進而影響轉化效率。我們可以利用分光光度計測量質粒濃度，再依照公式：體積（μL）= 目標質量（ng） / 質粒濃度（ng/μL），計算出所需添加的體積。

某些質粒需要特定宿主菌才能正常復制或表達。例如pET系列質粒需使用BL21(DE3)菌株表達蛋白，因為該菌株通過λ噬菌體DE3溶源整合，染色體攜帶T7 RNA聚合酶基因，可驅動pET質粒的T7啟動子轉錄目標基因。若質粒與宿主菌的復制起點不兼容不匹配，則可能導致質粒無法復制，轉化后無菌落。

4 熱激條件不“精準"

熱激是感受態細胞吸收質粒的關鍵步驟，其溫度、時間和操作順序需嚴格控制。若條件不精準，可能導致質粒無法有效進入細胞或細胞膜修復過快，影響轉化效率。熱激時間過短，會導致無法充分打開細胞膜孔道；而熱激時間過長則可能損傷細胞。

熱激完后，我們還需要將細胞放在冰上冰浴一段時間，這一步的目的是修復細胞膜裂隙，避免細胞因膜結構破損而死亡。如果少了這一步，就可能導致細胞膜無法閉合，轉化效率下降或細胞死亡。

5 抗生素“過量"或“失效"

抗生素是篩選成功轉化的抗性菌落的關鍵，但如果抗生素失效或濃度過高會直接導致轉化菌篩選失敗。儲存不當或過期的抗生素會失去抑菌活性，而濃度過高則會抑制目標菌生長。操作失誤，如使用添加錯誤類型抗性平板，也會導致實驗失敗。

6 涂板操作不“細致"

涂板是轉化的最后一步，一些操作上的細節疏漏也可能導致前功盡棄。涂布量過多或過少會影響菌落密度與生長效率，建議控制涂布量在10-50 μL。菌液未充分混勻或涂布器未覆蓋整個平板表面，導致局部菌落過密或空白。而如果使用涂布棒用力摩擦瓊脂表面，損傷細胞或菌液堆積。

正確的操作應該是：加入菌液后，使用無菌涂布棒輕柔旋轉，充分分散菌液；涂布后需靜置5分鐘，待菌液被平板全部吸收后再倒置培養，防止冷凝水滴落污染菌落。

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