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    ATAC-Seq 實(shí)驗(yàn)操作指南---01 ATAC-Seq 原理介紹

    發(fā)布時(shí)間: 2025-01-08  點(diǎn)擊次數(shù): 1603次

    01 ATAC-seq 原理介紹

    染色體結(jié)構(gòu)

    人類基因組DNA直線長(zhǎng)度接近2m,而細(xì)胞的平均直徑一般在幾十微米,要保證DNA的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控能夠準(zhǔn)確、高效的進(jìn)行,需要將細(xì)胞核中的DNA經(jīng)過(guò)多個(gè)水平高度有序的包裝。

    2個(gè)H3-H4二聚體和2個(gè)H2A-H2B二聚體形成約11nm的組蛋白八聚體,DNA纏繞其上形成核小體,每個(gè)核小體上大約含有146bp的DNA,核小體相互串聯(lián)成為30nm水平纖絲染色質(zhì)。細(xì)胞周期的不同時(shí)期,染色質(zhì)濃縮程度不同,在分裂間期,染色質(zhì)相對(duì)松散,具有轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)DNA暴露區(qū)域也可被特定的核酸酶接近并切割,而在分裂期,染色質(zhì)進(jìn)一步包裝為結(jié)構(gòu)緊密的染色體狀態(tài),此時(shí)呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄惰性。

    染色質(zhì)可接近性概念

    染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì),在結(jié)構(gòu)上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低,處于伸展?fàn)顟B(tài)。DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄時(shí),DNA的致密高級(jí)結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮顟B(tài),這部分打開的染色質(zhì),稱之為開放染色質(zhì)(open chromatin)。染色質(zhì)一旦被打開,就允許一些調(diào)控蛋白,比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子與之相結(jié)合,染色質(zhì)的這一特性,就叫做染色質(zhì)可接近性(chromatin accessibility)。這一特性反映了染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍程度。特定條件下的染色質(zhì)開放性變化可以提供大量的基因表達(dá)調(diào)控信息。

     Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.

                                                                                     

      圖2:染色質(zhì)的可接近性轉(zhuǎn)換

    轉(zhuǎn)錄因子及基因表達(dá)調(diào)控

    真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程是大量的順式作用元件與反式作用因子相互作用的結(jié)果,具有調(diào)控功能的反式作用因子通過(guò)結(jié)合染色質(zhì)開放區(qū)域調(diào)控真核細(xì)胞基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并結(jié)合起始位點(diǎn)上游序列,如GC Box、CAAT Box和TATA Box等順式作用元件,從而啟動(dòng)基因的開放表達(dá)。遠(yuǎn)端調(diào)控的增強(qiáng)子,沉默子、絕緣子同樣也可以通過(guò)結(jié)合順式作用元件參與調(diào)控基因表達(dá)的開放和關(guān)閉。轉(zhuǎn)錄因子與基因組結(jié)合時(shí),取代了核小體的位置,暴露出DNA,使其對(duì)酶的切割更為敏感。在此基礎(chǔ)上,利用染色質(zhì)對(duì)DNase的敏感性,鑒定活化的調(diào)控序列。基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程,在轉(zhuǎn)錄和翻譯中,染色體三維結(jié)構(gòu)也會(huì)處于動(dòng)態(tài)變化中。 

    全基因組染色質(zhì)可接近性研究       

                      

    目前染色質(zhì)可接近性的研究方法主要通過(guò)酶解或者化學(xué)方法來(lái)分離可接近區(qū)域或者受保護(hù)區(qū)域的DNA序列,然后再經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序分析。轉(zhuǎn)座酶引入高通量測(cè)序之前,基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq,DNase-seq和FAIRE-seq,這些方法可以幫助我們?cè)诖罅康募?xì)胞系和組織樣本中鑒定出轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄活性開始的位置、核小體和核小體修飾、增強(qiáng)子和絕緣子等。

    MNase-seq:微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease,MNase)是一種限制性外切酶,進(jìn)行片段化處理時(shí),將DNA切成缺口后,逐個(gè)切除寡核苷酸,直到獲得被核小體包裹或者被轉(zhuǎn)錄因子綁定的區(qū)域?yàn)橹埂D壳癕Nase消化法和二代測(cè)序聯(lián)合使用,通過(guò)定性和定量的方式來(lái)識(shí)別基因組范圍內(nèi)的平均核小體占據(jù)率、定位以及染色質(zhì)開放區(qū)域。

                                        圖4:MNase-Seq原理圖

    DNase-seq:基因活躍表達(dá)時(shí)啟動(dòng)區(qū)域部分序列可能解旋成單鏈,從而不能繼續(xù)纏繞在核小體上,使啟動(dòng)區(qū)DNA裸露在組蛋白表面,形成對(duì)DNaseI的超敏現(xiàn)象。容易被DNase|切割的位點(diǎn)稱為超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子和轉(zhuǎn)錄因子等的結(jié)合位點(diǎn)。DNase-seq技術(shù)與MNase-seq技術(shù)互補(bǔ),利用DNase|優(yōu)先切割超敏感位點(diǎn)然后對(duì)生成的片段進(jìn)行測(cè)序。該方法可用于檢測(cè)特定轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合位點(diǎn)。

    FAIRE-seq: FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements)甲醛輔助分離調(diào)控元件,是借助有機(jī)溶劑甲醛對(duì)染色體中裸露的DNA 進(jìn)行固定,通過(guò)細(xì)胞裂解與超聲打斷再進(jìn)行CHCL3抽提獲取水相中的DNA,在CHCL3抽提的過(guò)程中,蛋白未交聯(lián)的DNA溶于水相中,而蛋白結(jié)合型的DNA留在兩相界面,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間3-4天。將FAIRE-seq與ChIP-seq、DNase-seq聯(lián)用可以用于揭示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核小體位置分布、染色質(zhì)開放區(qū)域以及三者之間的關(guān)系。

    這些研究染色質(zhì)開放區(qū)域、核小體定位、轉(zhuǎn)錄因子占位或者染色質(zhì)生物學(xué)“狀態(tài)"的注釋方法都涉及多個(gè)試驗(yàn)流程,操作復(fù)雜,需要大量細(xì)胞作為研究樣本,并且樣本準(zhǔn)備過(guò)程非常繁瑣。

    為了解決這些問(wèn)題,2013年Standford 大學(xué) William Greenleaf 實(shí)驗(yàn)室的Buenrostro等發(fā)布了一項(xiàng)整合的、多維的遺傳學(xué)分析方法-ATAC-seq,這種方法通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座酶將測(cè)序的adapters插入到基因組上的“可接近"區(qū)域來(lái)標(biāo)記調(diào)控區(qū)域。

     

    ATAC-seq

    ATAC-seq 全稱 Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing,是利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可接近性的高通量測(cè)序技術(shù)。其原理是利用轉(zhuǎn)座酶Tn5可切割開放染色質(zhì)區(qū)域的特性,對(duì)Tn5酶捕獲到的DNA序列進(jìn)行測(cè)序。DNA轉(zhuǎn)座,是把DNA序列從染色體的一個(gè)區(qū)域搬運(yùn)到另外一個(gè)區(qū)域的現(xiàn)象,由DNA轉(zhuǎn)座酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。只要人為地將攜帶已知DNA序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物(即下圖中帶紅/藍(lán)色序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座酶Tn5復(fù)合物)與細(xì)胞核一起孵育,再利用帶P5、P7以及index的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可形成文庫(kù),經(jīng)過(guò)測(cè)序就可以得到開放染色質(zhì)的區(qū)域信息。

      

    ATAC-seq 可低至20個(gè)細(xì)胞便能快速的獲取調(diào)控的多維信息,更加適用于珍貴稀少的樣本,且ATAC-seq無(wú)片段選擇性,所以這種方法可以同時(shí)獲得“開放"染色質(zhì)的位置、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體的調(diào)控區(qū)域和染色質(zhì)狀態(tài)等信息。

    相對(duì)于其他三種染色質(zhì)開放區(qū)域研究,ATAC-seq經(jīng)過(guò)一次實(shí)驗(yàn),能夠獲得染色體在某個(gè)特定時(shí)空條件下所有開放染色質(zhì)區(qū)域,并不僅僅局限于某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),或者某個(gè)特定的組蛋白乙酰化區(qū)域。


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