假陽性？條帶不對？菌液PCR問題一網打盡

1.平板長菌，但挑的單克隆菌落搖不起來？

產生原因及解決辦法：

（1）挑取的單克隆為雜菌，呈假陽性。出現這種情況的原因包括：①配制平板過程中，加入抗生素時溫度過高致使抗生素滅活；②配制平板過程中，抗生素濃度過低；③平板培養時間太長導致抗生素失效。

（2）液體培養基的抗生素使用錯誤。

（3）液體培養基抗生素濃度過高，導致大腸桿菌生長緩慢。

（4）菌液保存太久，導致菌的活力過低。辦法：重新劃線涂板，挑取單克隆。

（5）自己制備的感受態細胞受到雜菌污染。

（6）噬菌體污染。現象描述：菌液清亮或渾濁后變為清亮，底部有沉淀。辦法：甲醛熏蒸超凈臺，對整個實驗環境進行消毒；重新提質粒，重新轉化。

2. 平板長菌，挑的單克隆菌落能搖起來，但菌液PCR沒有條帶？

產生原因及解決辦法：

（1）重組或連接失敗。出現這種情況的原因包括：①質粒沒有切開；②質粒切開后自連。

（2）搖菌時間過長，菌液濃度過大。辦法：搖菌不超過6小時，4-5小時即可。

（3）PCR反應體的原因。出現這種情況的原因包括：①酶；②引物。辦法: 換酶，使用熱啟動酶；使用載體通用引物。

3. 平板長菌，挑的單克隆菌落能搖起來，但菌液PCR與陽性對照的大小不對？

產生原因及解決辦法：

（1）引物特異性差，導致擴增到大腸桿菌的基因。辦法：使用載體的通用引物。

（2）目的基因存在所用酶的酶切位點，酶切位點切錯，僅部分連接，導致片段變小。

（3）小片段核酸污染。這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后擴增出條帶。

（4）瓊脂糖凝膠電泳會產生偏差，相差一點極有可能是目的條帶。辦法：送測序進行驗證。

4. 平板長菌，挑的單克隆菌落能搖起來，但菌液PCR出現多條條帶？

產生原因及解決辦法：

（1）引物特異性差，導致擴增到大腸桿菌的基因。辦法：使用載體的通用引物。

（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，PCR循環次數過多。

（3）酶量過多或酶的質量差。

（4）菌落污染。

5. 平板長菌，挑的單克隆菌落能搖起來，菌液PCR也有目的條帶，但測序無信號？

產生原因及解決辦法：

（1）未連接到載體的目的片段仍存在在菌液里，單克隆的菌落為原始質粒，菌液PCR有條帶。

（2）污染。出現這種情況的原因包括：①菌液污染。②酶，引物，Buffer等污染。③氣溶膠污染。

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