Dot blot法鑒定分泌型蛋白表達

實驗原理：

Dot blot是一種半定量的蛋白質(zhì)或核酸檢測方法，其原理是將待測物直接滴于固相載體上，然后通過特異性抗體或探針與待測物結合，最終通過可視化方法來檢測目標分子的存在與否。

溶液配置：

操作步驟：

（1）減取適當大小的PVDF膜，于甲醇活化1分鐘；

（2）將活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脫色搖床上清洗15分鐘；

（3）提取預冷離心機，將樣品在4℃低溫條件下8000 rpm離心15分鐘，取上清作為樣品（分泌型蛋白）。

（4）取出活化后的PVDF膜在室溫晾至半干，看見水膜消失即可。將收集的上清、空白對照、陽性對照分別取5ul點樣至PVDF膜上，風干。室溫待樣品吸收，樣品吸收后點樣處顏色加深。

（5）封閉：待PVDF膜上樣品干燥后，于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或者4℃過夜孵育。

（6）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（7）一抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋一抗，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或4℃過夜孵育。

（8）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（9）二抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋二抗，37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h。

（10）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（11）曝光：用濾紙吸干PVDF膜上的TBST溶液，滴加ECL超敏顯色劑（A液：B液=1：1），提前將化學曝光儀預冷，進行曝光，觀察并記錄結果。

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