細胞培養如何杜絕污染？

下表列出了幾乎所有的需要注意的細節，大家可以對照自己的操作和習慣進行檢查，也可以將圖片下載保存或者收藏，等到自己成為大師兄，就有材料“教育“小師弟啦！

工作區域：

1.細胞培養通風櫥設置是否正確？

2.細胞培養通風櫥所在區域有無氣流和直接出入通道？

3.工作臺面是否整潔？

4.是否僅僅放置了實驗所需的物品？

5.開始工作前用70%乙醇擦拭工作臺面了嗎？

6.是否定期對培養箱、冰箱、冰柜及其他實驗設備進行清潔和消毒？

個人衛生：

1.您洗手了嗎？

2.您穿戴個人防護設備了嗎？

3.如果您留了長發，頭發是否扎在后面了？

4.您是用移液器操作換液嗎？

5.試劑和培養基

6.您采用適當的方法對實驗室中配制的所有試劑、培養基和溶液進行滅菌了嗎？

7.在將容器、培養瓶、培養板和培養皿放入工作臺面之前，您用70%乙醇擦拭其外部了嗎？

8.試劑瓶、培養瓶及其他容器不使用時蓋緊了嗎？

9.是否已將所有培養板均放入無菌重復密封袋中？

10.是否有試劑外觀渾濁？是否污染了？試劑中是否有漂浮顆粒嗎？有難聞氣味嗎？有顏色異常嗎？如果出現上述情況，是否已對其進行去污或丟棄？

操作：

1.您操作時是否緩慢、謹慎、注意無菌技術？

2.在將移液器、試劑瓶和培養瓶放入細胞培養通風櫥之前，用70%乙醇擦拭其表面了嗎？

3.是否將蓋子口朝下放置在工作區域？

4.您是使用無菌玻璃吸管或者一次性無菌塑料吸管操作液體嗎？

5.無菌吸管是否僅僅使用一次以免交叉污染？

6.您是否注意到避免使吸管比較尖的一端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣？

7.發生液體潑濺時是否立即吸干并用70%乙醇擦拭該區域？

知己知彼，方能百戰不殆"了解了如何防止污染，我們還需要知道如何識別污染，畢竟，污染的細胞是要及時忍痛扔掉的，否則讓污染物集齊所有寶石，那可就……

細胞培養污染主要分為兩類，一是化學污染物，例如：培養基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑。二是生物污染物，例如：細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。

細菌污染

細菌外形多樣，可呈球狀、桿狀和螺旋狀。細菌和霉菌一起構成了細胞培養中最常遇到的生物污染物。細胞被細菌污染后，往往一兩天內即可通過簡單的肉眼觀察發現，培養基的pH值也會突然降低。下圖為貼壁生長的293細胞被大腸桿菌污染。

霉菌污染

 霉菌污染初期培養物的pH值會維持穩定，污染加重后pH值會迅速升高，導致培養基渾濁。在顯微鏡下，菌絲通體常呈細束狀纖維，有時呈較為密集的孢子團塊。孢子在休眠期可以耐受十分嚴峻、不利的環境，因此當霉菌污染時，一定要果斷及時扔掉細胞，防止在敷箱內大規模污染。

酵母污染

 與細菌污染類似，培養基被酵母污染后也會變得渾濁，特別時進入污染后期時。培養物被酵母污染后pH值變化極小，污染嚴重時才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒，有些會芽生出叫囂的顆粒。下圖為被酵母污染的293細胞。

病毒污染

 病毒體積極小，因而要檢測有誤病毒以及將其從細胞培養所用的試劑中去除都十分困難。由于大多數病毒對宿主有非常嚴格的要求，因此一般不會對與其宿主物種不同的細胞培養物造成不良影響。但是，使用病毒感染的細胞培養物時卻會對實驗操作者造成嚴重的健康威脅。

支原體污染

 支原體被認為時能夠自我復制的最小生物。由于體積極小，支原體的檢測十分困難，除非達到非常高的密度，否則再次之前往往沒有明顯的感染征象。有些支原體甚至會在培養物中持續存在，而不導致細胞死亡，但是這些支原體會改變培養體系中細胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現包括：細胞增殖速度降低、胞核密度下降以及懸浮培養的細胞凝集。切實有效的檢測支原體污染的方法就是熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學測定技術定期檢測培養物。

交叉污染

 雖然不如微生物污染普遍，但是許多細胞系與HeLa細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是一個明確的問題。從聲譽可靠的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系的性質以及采用良好的無菌技術是有助于避免交叉污染的慣例方法。

抗生素的使用

 細胞培養的時候不應常規使用抗生素，因為聯系使用抗生素會促進耐藥菌株的產生，導致輕度污染持續存在。一旦將抗生素撤去，這種輕度污染最終將發展成為大規模污染，而且連續使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他污染。因此，抗生素只能作為對付污染的最后手段，而且只能短期使用，并應盡快撤除。

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