細(xì)胞毒性分析

原理

以CCK-8法為例簡(jiǎn)述其原理：CCK-8試劑盒中含水溶性四唑鹽WST-8 (化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黃色甲瓚燃料，而甲臜染料的生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成線性關(guān)系。

用途

1、藥物篩選實(shí)驗(yàn)；
2、腫瘤藥敏試驗(yàn)；
3、生物活性因子的活性檢測(cè)；
4、細(xì)胞增殖測(cè)定等；

材料與儀器

【材料】細(xì)胞懸液，化合物溶液、CCK8試劑、*培養(yǎng)基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA

【儀器，耗材】96孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm酶標(biāo)儀

步驟

1、根據(jù)具體細(xì)胞類型確定其在 96 孔板種植密度，以對(duì)照組細(xì)胞密度至檢測(cè)時(shí)達(dá)到 70%-90%為參照，每組設(shè)置 3-6 個(gè)復(fù)孔，孔板邊緣空不用，加入與培養(yǎng)基等體積的無菌 PBS 溶液；

2. 每孔加入培養(yǎng)基體積 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培養(yǎng)體積為 200 微升，則需加入 20 微升 CCK-8 溶液，其它情況以此類推。同時(shí)以加了相同體積細(xì)胞培養(yǎng)液和 CCK-8 溶液但沒有細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。若所用藥物會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，則選加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但無細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照（注意不可產(chǎn)生氣泡）；

3. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 2-4 小時(shí)，建議選取2、3、4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

4. 在 450 nm測(cè)定吸光度。如無 450 nm濾光片，可以使用 420-480 nm的濾光片。可以使用大于 600 nm的波長(zhǎng)，例如 650 nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

注意事項(xiàng)

1、本實(shí)驗(yàn)使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，周圍一圈最容易蒸發(fā)，檢測(cè)會(huì)因體積不準(zhǔn)確而增加誤差故棄用周圍一圈，加入等體積相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；

2、本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，因而還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測(cè)，如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。

3、用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定；

4、酚紅和血清對(duì)CCK-8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

5、試劑有一定的毒性，請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

6、試劑要注意避光4oC或-20oC保存；

常見問題

1. 如果細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，且細(xì)胞較小，可以最大接種1x10^4 cells/well，但加入化合物后處理時(shí)間最長(zhǎng)為72 h。

2. 化合物如果難溶于水，可以在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加DMSO、DMF以助溶，但最大濃度不宜超過0.5%，因?yàn)镈MSO和DMF對(duì)細(xì)胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶，需保證其他濃度的化合物DMSO、DMF的濃度也相同。

3.若吸光度值太低，怎么辦法？
1）適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量；
2）延長(zhǎng)加入CCK-8溶液后的孵育時(shí)間