免疫組化IHC實驗經驗總結

1、免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最為常用、最基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中最佳的組織標本制作方法。

2、石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？

石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要*行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

3、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最為常用。

4、石蠟切片在染色過程中出現脫片現象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。 

5、邊緣效應

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

6、產生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 

3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 

4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果； 

5）DAB孵育時間過長或濃度過高； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

7、免疫組化染色呈陰性結果

1）抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤；   

2）抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

8、背景

1）考慮一抗濃度高；

2）然后調整DAB孵育時間；

3）也要考慮血清封閉時間是否過短；

4）適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長浸洗時間等。

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