流式細胞術的空白對照、同型對照、FMO對照要怎么選？

流式數據分析時，應該把門設在哪里合適呢，特別是那些分群不明顯的結果。

我們知道流式細胞術常見的有空白對照（未染色細胞）、同型對照和FMO對照，每種對照適用于什么情況呢？

1、空白對照：空白對照的作用是作為電壓調節的參考，調整電壓參數使細胞信號在圖上各個通道的合適位置。同時，也是可以看到細胞的本底信號，圈門時直接排除。

未處理的細胞，不能作為處理組細胞的圈門依據，需要使用相同處理組的空白對照，來觀察細胞的本底信號。

空白對照適用于細胞分群明顯、背景熒光弱、已有大量研究的分群明確的細胞群圈門，例如CD3、CD4、CD8等等。

2、同型對照（isotype）：同型對照的作用是排除背景熒光，使用同型對照可以更準確地排除假陽性。

例如，以下這張圖，黑色線的是空白對照，黃色是同型對照，紅色是實驗組染色細胞，可以看出同型對照和空白對照會有所差別，會有少量的非特異性染色。

當非特異性染色比較強時，如果繼續用空白對照作為圈門依據，實驗結果就不能準確反映真實情況了。

一般抗體說明書都會有同型對照和抗體染色的驗證圖，我們在選擇抗體時盡量選擇陽性峰與同型對照峰分得比較開的，通常抗體公司也會有此抗體對應的同型對照出售。

3、FMO對照：FMO對照也叫做熒光扣除對照/抗體減一對照（Fluorescence-Minus-One Control），是指在多色染色分析時，對其中某一個通道設置的陰性對照，也就是不染目標通道的顏色，其他指標都染色。多在研究不同細胞亞群表達某些重要的表型分子、細胞因子等時應用。

FMO對照有兩個作用：

（1）多色分析時，有些通道的信號不好區分，可能存在某個熒光對該通道干擾很大，可以使用FMO對照來找到這個熒光。

（2）作為我們需要重點分析的某個指標的陰性對照，可以排除全染的背景影響，有助于更準確地圈門。

對于一些分群不明顯，或表達量不高的指標，使用FMO對照作為圈門依據會比空白對照更合適。

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