如何提高蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（Western Blot）的成功率？

近些年來，蛋白質(zhì)組學(xué)研究是生物領(lǐng)域比較熱門和研究廣泛的方向。而Western Blot實驗是研究蛋白組學(xué)的基本實驗操作。但是一個成功的Western Blot實驗結(jié)果需要注意很多細節(jié)。

Western Blot即蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，利用抗原抗體特異性結(jié)合來檢測目的蛋白的表達量。蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士*弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中第一次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡（Western Blot）是將電泳分離后的細胞或組織中的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

下面詳細介紹每一步的操作：

一、樣品的制備

樣本來源一般分為細胞和組織，常用的裂解液為RIPA（強）裂解液，需要加入適量的蛋白酶抑制劑。根據(jù)所收集的細胞沉淀多少或組織塊大小，加入適量的裂解液。根據(jù)說明書，冰上裂解10min或30min，定時進行渦旋震蕩。用BCA試劑盒進行蛋白定量，加入Loading Buffer于99℃的金屬浴上煮樣10min。

*加入的Loading Buffer目的

二、凝膠電泳

* SDS凝膠配置原則：

  先配置分離膠，再配置濃縮膠；

  分子量越高，分離膠濃度越低；

  根據(jù)上樣量選擇對應(yīng)的玻璃板和梳子。

  配膠成分表：

配膠注意事項：

  （1）清洗玻璃板：可以先用海綿擦清洗玻璃板，在用去離子水潤洗一次，可以放置于烘箱或通風(fēng)廚中晾干。

  （2）按照配膠表進行配置，充分混勻后在玻璃板中灌膠。

  （3）加水或者醇類液封，速度要慢，防止將分離膠沖不勻或變形。

* 電泳

采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣量可為20-50ng。在適當空內(nèi)加入marker。先用80V電壓使樣品進行充分濃縮，到達分離膠后調(diào)為120V，當溴酚藍要跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。

* 轉(zhuǎn)膜

一般分為PVDF膜和NC膜，PVDF膜價格較貴，結(jié)合能力較強；NC膜價格便宜，結(jié)合能力較PVDF膜差，不能重復(fù)使用。

PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20 kDa的蛋白選用0.45 um的膜，小于20 kDa的蛋白選用0.2 um的膜。PVDF膜在使用時需預(yù)處理，用甲醇激活15s，目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結(jié)合（注意：不要有氣泡！不要將膠放干！原理：電場力作用條件下，PAGE膠中的帶負電荷的蛋白會發(fā)生定向遷移）。轉(zhuǎn)膜過程會產(chǎn)熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，因此要使用冰袋散熱。目前市面上的快速轉(zhuǎn)膜液可以在常溫下400mA轉(zhuǎn)30min完成，方便快捷。

注意事項：

  如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的，最后結(jié)束時一般是開始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和濾紙選的對就不會短路。

轉(zhuǎn)膜方法：濕轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)膜后可以用麗春紅對膜進行染色，檢驗轉(zhuǎn)膜效率。

* 封閉

一般用5%的脫脂奶粉或者5%的BSA進行封閉。對于磷酸化或者生物素標記的抗體只能用5%的BSA。封閉是假為室溫1-2h。目的是去除非特異性結(jié)合。

* 一抗孵育

封閉后用TBST潤洗一次，然后根據(jù)蛋白的分子量大小進行裁膜，將對應(yīng)的膜放入用一抗稀釋液配好的抗體中（具體稀釋比例要根據(jù)抗體說明書進行）。在4℃條件下置于搖床上孵育過夜。

* 洗膜

一抗孵育結(jié)束后，回收一抗，用TBST洗膜，每次7min，洗3次。

* 二抗孵育

洗膜結(jié)束后，加入配好的二抗（對應(yīng)好一抗的種屬來源），室溫下置于搖床上1h，然后回收二抗，再次洗膜。

* 顯影

將PVDF膜洗干凈后，滴加ECL發(fā)光液，孵育1min左右，可進行顯影。

Western Blot可能遇到的問題：

無顯色信號問題的原因分析：

1．裂解產(chǎn)物中抗原含量不足；

a. 抗原無表達或表達量過少

b. 蛋白降解或上樣量不足

c. 裂解產(chǎn)物制備失誤

2．制膠濃度比例不合適；

3．轉(zhuǎn)膜不*；

4．一抗稀釋濃度過大；

5．二抗與一抗不匹配；

6．顯色系統(tǒng)靈敏度不足 

非特意性雜帶出現(xiàn)的原因分析：

1．封閉或清洗不*；

2．一抗?jié)舛冗^高；

3．蛋白降解；

4．抗體與非特異性蛋白交叉反應(yīng)；

5．蛋白間聚集作用，形成二聚體；

6．轉(zhuǎn)移膜使用不當；

7．操作過程中轉(zhuǎn)移膜干燥

有一些污點的原因分析：

1．轉(zhuǎn)膜有氣泡；

2．孵育不均勻；

3．脫脂奶粉沒有充分溶解

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