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      大鼠肝星狀細胞原代培養實驗——胰酶消化法

      發布時間: 2021-12-04  點擊次數: 2061次

      材料與儀器

      SD大鼠
      戊巴(匕匕)妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚紅 臺盼蘭 HBSS 氯化鈉 PBS
      手術刀 手術剪 尼龍網 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

      步驟


      一、實驗材料準備

      1.  動物:雄性SD大鼠(體重250-450 g)。
       
      2.   試劑:戊巴(匕匕)妥鈉,小牛血清(或胎牛血清,則更好),DMEM,酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配),18% Nycodenz(以GBSS配),D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L,KH2PO4 0.06 g/L,NaCl 8.0 g/L,NaHCO3 0.35 g/L,Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,可加酚紅 0.02 g/L),HBSS,臺盼蘭等。
       
      3.  器械:手術器械,200目尼龍網,相差顯微鏡,熒光顯微鏡。
       
      二、原代培養方法
       
      1.  大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹,進行門靜脈插管,以D-Hanks'液灌注,同時剪開下腔靜脈,沖掉血液后,改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。

      2.  待肝臟變軟后,離體肝臟并剪碎,繼續以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min,尼龍網過濾后以450 g 離心5 min(4℃,下同)。

      3.  以HBSS重懸沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz液,分置于離心管中,并分別覆以2-3 ml HBSS,1450 g離心16 min后取界面細胞。

      4.  以HBSS重懸后再次離心收集細胞,以DMEM重懸后進行細胞計數,并判斷存活率和產量,最后按照常規方法接種(105細胞/cm2),次日換液,以后每2-3天換液一次。
       
      三、傳代方法

      棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次,加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化,鏡下觀察細胞突起回縮(2-5 min左右),以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA,可以不需離心),充分吹打后以1:2-1:3接種,然后繼續培養(5%CO2,37℃)。
       
      四、 結果
      接種次日,光鏡下可見細胞呈星芒狀,胞質內有脂滴,熒光鏡下328 nm處見自發熒光。附上發表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。


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