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    核提取物的制備方法

    發布時間: 2021-11-24  點擊次數: 2012次

    材料與儀器

    轉瓶或單層培養的哺乳動物細胞(如HeLa細胞)
    PBS 低滲緩沖液 高鹽緩沖液 含1. 2 mol L KCl 透析緩沖液 液氮
    貝克曼 JS4. 2 轉子或相當的轉子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管(對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管) Dounce 氏玻璃勻漿器(B 型研杵) Beckman JA-20 離心轉子或相當的轉子磁性攪拌器或傾斜臺 Beckman JA-20 離心轉子或相當的轉子磁性攪拌器或傾斜臺、 管型透析膜(14000 MWCO)、電導計

    步驟


    1a) 收集轉瓶培養的細胞:將 5× 108?10× 108 細胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄,將細胞轉入50 mL 錐形刻度離心管中(每管 2?3 L 培養液中的細胞)。進行步驟 2。


    1b) 收集單層培養的細胞:單層細胞長滿后去掉培養液。用足量 PBS 洗 1 次,PBS 用 量為沒過細胞,輕輕振蕩,棄 PBS。將細胞刮入新鮮 PBS 液里,倒進錐形刻度離心管中。進行步驟 2。


    2) 1850 g 離心 10 min。進行步驟 3a 轉瓶培養或步驟 3b 單層培養。


    3a) 轉瓶培養細胞:輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量壓緊后細胞的體積 (Pcv)將細胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進行步 驟 4。


    3b) 單層培養細胞:輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量 pcv, 進行步驟 4。


    4) 快速地將沉淀的細胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清。


    5) 將細胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中,放置在冰上 10 min,讓細胞腫脹。


    6) 將細胞轉到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中,用 B 號研杵上下抽提 10 次。用臺盼藍染色排斥法在顯微鏡下檢査細胞裂解情況(應大于80%?90%)。


    7) 將細胞轉到離心管中。用 JS4.2 轉子 3300 g 離心 15 min 收集細胞核。保留上清用來制備 S-l00 細胞質提取物。


    8) 用離心管上的刻度測量第 7 步離心壓緊后的細胞核體積(pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細胞核。


    9) 在輕輕攪拌的同時,逐滴加入1/2 pnv 體積(見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。


    10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內容物。


    11) 用 Beckman JA-20 轉子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測量其電導率(見步驟 12),這就是核提取物。


    12) 將核提取物加入透析管中,用夾子至少封住透析袋的一端;透析袋一端是打開的, 這樣就可以測量透析袋內核提取物的電導率,比較核提取物電導率和透析液電導率 的不同,以確定是否需要進一步透析。在 50 倍體積的透析液中進行透析,直到提 取物的電導率和透析液一致為止(即提取物的 KCr 濃度達到 100 mmol/L 時)。盡量縮短透析時間。


    取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測電導。用電導測量儀直接讀出稀釋液的電導值,與同樣稀釋的透析液的電導值相比較。


    13) 將提取物從透析袋中移出,最后一次檢測其電導率以確定透析已經完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。


    14) 測定上清中蛋白質濃度。根據需要分裝,浸入液氮中速凍,-80℃保存。



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