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成骨細胞原代培養(yǎng)實驗步驟

發(fā)布時間： 2021-11-15　　點擊次數(shù)： 1681次

材料與儀器
骨標本
Hams F12 培養(yǎng)液用于細胞傳代的胰蛋白酶液分離成骨細胞的消化液
Petri培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶手術(shù)刀手術(shù)鑷
步驟
一、外植塊培養(yǎng)

1. 從手術(shù)室獲得骨標本。

2. 在室溫條件下，用無菌生理鹽水浸洗骨組織數(shù)次。

3. 如果骨組織不能及時使用，將骨標本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的 Ham’s F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素）培養(yǎng)液中。骨標本可在 4℃條件下儲存過夜。

4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素的 Tyrode 液浸洗骨組織。

5. 將骨組織放入 Petri 培養(yǎng)皿，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷取骨小梁，然后將骨小梁移入另一個 Petri 培養(yǎng)皿。

6. 加入 10 ml Tymde 液，淹蓋切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁數(shù)次，直至除去血液和脂肪細胞。

7. 為了進行植塊培養(yǎng)，將 2 ml *培養(yǎng)液放入 25 cm2 培養(yǎng)瓶，預(yù)孵育 20 min，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液。根據(jù)需要，用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 調(diào)整 pH 。

8. 將骨小梁切成 1~3 mm 小塊。

9. 吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)的預(yù)孵育培養(yǎng)液，然后加入 2.5 ml 新鮮的 Ham's F12培養(yǎng)液。

10. 將 25~40 塊骨小梁放入培養(yǎng)瓶。

11. 將培養(yǎng)瓶直立，用接種環(huán)沿著培養(yǎng)瓶底壁滑動植塊，使植塊均勻分布。

12. 在 37℃條件下，將培養(yǎng)瓶直立放置 15 min。

13. 慢慢地使培養(yǎng)瓶恢復(fù)為正常的橫置位。植塊黏附于培養(yǎng)瓶底壁。

14. 在37℃ 條件下，將培養(yǎng)瓶橫置 5~7 d。此后，檢査細胞長出情況，換培養(yǎng)液。為了預(yù)防植塊脫離，在將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱移于超凈工作臺內(nèi)或顯微鏡上之前，將培養(yǎng)瓶慢慢地直立起來。

15. 每周換培養(yǎng)液 2 次，以維持培養(yǎng)。

16. 細胞生長形成單層時，取出植塊，用胰蛋白酶（將 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca2＋和 Mg2＋的 Tyrode 液。調(diào)整 pH 至 7.0，過濾除菌。用 Pyrex 管分裝成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 條件下儲藏）消化細胞。通過離心分離細胞，然后將細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。

二、分離細胞的單層培養(yǎng)

1. 用 Tymde 液反復(fù)沖洗松質(zhì)骨，洗去脂肪和血細胞。在無菌條件下，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷切除骨小梁。

2. 取到較多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遺留的血液和脂肪細胞。將骨小梁切成 2~5 mm 小塊。

3. 用含有 FCS 的 F12 培養(yǎng)液洗骨小梁塊。

4. 將組織塊放人盛有磁力攪拌棒的無菌小瓶內(nèi)，然后加入 4 ml 消化液（分離成骨細胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O，用 100 ml 超純水配制。②B 液（膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：將 137 mg 膠原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。調(diào)整 pH 至 7.2，然后用超純水配成 100 ml。過濾除菌后，分裝成 10 ml，在 -20℃ 條件下儲藏）。加入的消化液應(yīng)淹蓋組織塊。

5. 在室溫條件下，將含有組織塊的液體攪拌 45 min。

6. 棄去細胞懸液，因為這些細胞中很可能含有成纖維細胞。

7. 加入 4 ml 消化液，在室溫條件下攪拌 30 min。

8. 收集消化液，在室溫條件下離心（580 g，2 min）。

9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培養(yǎng)液混懸細胞，計數(shù)細胞。

10. 將細胞懸液離心（580 g，10 min）后，用 4 ml *培養(yǎng)液混懸細胞。將此細胞懸液作為接種物。

11. 將 75 cm2 培養(yǎng)瓶用 8 ml * F12 培養(yǎng)液預(yù)孵育 20 min，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液。

12. 吸去預(yù)孵育培養(yǎng)液，然后加入 2 ml *F12培養(yǎng)液。

13. 加入 4 ml 細胞懸液，接種密度為 6000~10000 個/cm2。

14. 最后加入 6 ml F12培養(yǎng)液，使總量成為 12 ml。

15. 在分離細胞期間，向剩余的骨組織塊加入 4 ml 消化液，重復(fù)消化 30 min 。

收集分離下來的細胞。如有必要，重復(fù)消化幾次。骨組織多時，消化時間可延長至 1~3 h 。每次消化后計數(shù)細胞，將分離的細胞分別接種于培養(yǎng)瓶。

細胞傳代

1. 取出植入的組織塊。

2. 吸去培養(yǎng)液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm2）浸洗細胞。

3. 向培養(yǎng)瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm2），在 37℃ 條件下孵育，直至細胞脫離瓶壁，且細胞彼此分離。用顯微鏡觀察細胞的脫離和分離。一般孵育 10 min 即可。

4. 將分離的細胞移入離心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培養(yǎng)液。

5. 離心（600 g，5 min）。

6 . 吸去上清液，用*培養(yǎng)液輕輕混懸細胞，反復(fù)吹打。

7 . 留兩份細胞份用于確定細胞密度，另一份用于 DNA 檢測。

8. 將剩余的細胞接種于先前用培養(yǎng)液平衡的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。細胞可在 24 h 內(nèi)貼壁。

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