成纖維細胞生長因子誘導血管生成模型實驗

一、成纖維細胞生長因子和肝素誘導基底膜蛋白提取物內的血管生成模型

1.  Matrigel 為一種基底膜提取物，主要由粘連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素。蛋白多糖和 nidogen/entactin 構成，經濾膜，制備成無菌液體。

2.  肝素溶解于無菌的PBS（pH7.4）中，濃度為16 000單位/ml，酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）經預先配備的無菌牛血清清蛋白/PBS溶液稀釋為0.25 ug/ml。

3.  于4℃把各種濃度的肝素或FGF與0.5~1.0ml 的 matrigel 混合，前者體積不超過后者的1%。

4.  把含有0~100 ng/ml aFGFHE 0~64 ug/ml 肝素的0.5 ml matrigel 用21號針注射到C57小鼠腹白線皮下。

5.  注射后matrigel 在皮下迅速形成單一的固體膠，10天后乙（酉迷）麻醉小鼠，沿腹白線剪開皮膚，剝離出膠塊。

6.  一部分應用Drabkin’方法進行血紅蛋白測定，另一部分經過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、染色。

7.  于光鏡下進行組織學檢查，記錄血管形成的數量。

8.  近年來，還有圓盤狀血管生成系統、大鼠海綿血管生成模型等用于抗血管生成藥物體內試驗。

二、內皮細胞粘附分析

1.  把對數生長期的內皮細胞，用無血清培養液洗三次，收集并重新懸浮含有0.1%BSA的無血清培養液中，濃度為5×105細胞/ml。

2.  也可預先將細胞與無血清培養液稀釋的不同濃度抑制劑在室溫下，孵育60 min。

3.  將細胞種入96孔培養板內（10 ul/孔），與37℃孵育30~90 min。

4.  用Dulbecco‘PBS液清洗細胞4 次，除去未粘附細胞，粘附細胞用20%甲醇稀釋的0.5%結晶紫染色、固定、漂洗和空氣晾干。

5.  用比例為1：1的乙醇和0.1 mol/l 構櫞酸鈉溶液洗滌染色細胞，用酶標儀在540 nm 測定吸收度（OD）。