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做好流式太難？可能方法就用錯了，解決思路看這里!
發布時間： 2021-11-02 點擊次數： 2668次流式細胞術（FCM）是利用流式細胞儀對單個細胞或者生物微顆粒的生物學性質進行分析的檢測方式。其特點是能夠快速、精準的分析單個細胞的多種特性，適用于定性、定量分析細胞膜、細胞質和細胞核中的各種細胞成分，還可以研究細胞的各種功能狀態等，特別適用于大量樣品的檢測。
現已被廣泛用于免疫學、細胞生物學、血液學、腫瘤學、微生物學等多個領域。典型的應用實例包括血液系統疾病的免疫分型，腫瘤學中細胞 DNA 的倍體和周期分析，細胞生物學研究中的細胞凋亡、增殖，細胞表面或胞內的抗原檢測等。
其中，流式技術較為廣泛的應用是使用流式抗體進行細胞的分型鑒定，常見的免疫表型分析實驗包括單細胞懸液制備、細胞表面或胞內抗體的染色、上機檢測等基本步驟。
兩種常見流式細胞標記法
直接法和間接法各有利弊
直接法：熒光標記的抗體直接與細胞的抗原結合，一步孵育后即可以進行細胞的流式上機檢測。直接法因為其方便快捷，交叉反應和背景少，是目前主流的流式標記手段。
間接法：細胞先與一抗進行孵育，然后熒光二抗再結合到一抗上形成免疫檢測復合物，后續即可以進行上機。當商品化的直標抗體無法獲得時，間接法可以作為補充，但間接法在多色實驗中很難避免種屬間的交叉反應，選擇性會大大受到影響。
兩種流式細胞標記法原理見圖 1。
圖 1 流式抗體標記常見的兩種形式
（左圖為直接法，右圖為間接法）
除選擇上述兩種商品化標記抗體外，還可使用抗體標記試劑盒標記抗體，獲取實驗所需的熒光標記抗體，但該方法對技術要求高，標記效果往往受多種因素影響。常見的傳統流式細胞標記方法，見表 1。
表 1 常見的傳統流式細胞標記方法
因素
直接法
間接法
標記試劑盒
耗時
一步操作，耗時少
多步操作，耗時長
耗時更長，往往需 1 個小時甚至數天
復雜性
不復雜，流程短
復雜，必須選擇合適的二抗，多色實驗中很難避免種屬間的交叉反應
流程更復雜，需要考慮多種因素如抗體濃度、專業技術知識、反應清洗等
靈活性
不靈活，商品化決定
靈活，使用不同的二抗可拓寬可測量靶標的范圍
操作更靈活，可人工組合偶連
靈敏度
低于間接法
反饋更靈敏，一抗上可結合多個二抗分子
低于間接法
背景
低背景，減少了非特異結合
更多背景，可能存在內源性結合
更多背景，操作復雜，任何環節出錯均會影響結果
多色流式分析
可同時定量檢測細胞多種特性但要求高
隨著流式細胞儀、單克隆抗體和熒光探針的不斷發展，流式分析已經從早期的單激光單色檢測，發展到可快速同時定量檢測一種細胞的多種特性，多色多參數多激光的檢測分析。
同時分析多個抗原或多種細胞特性的能力為越來越復雜的實驗打開了新的大門，但多色流式細胞分析需要平衡多個難題的解法，包括儀器配置、抗原表達和染料亮度，以及可用的抗體- 染料組合等，考慮的要素見圖 2。
圖 2 流式多色方案設計需要考慮的要素
流式的配色需要綜合考慮以下因素：
儀器的配置：抗體所選擇的熒光染料必須根據儀器的激光通道以及相應的濾片配置進行選擇。
抗原的表達量：待測細胞類群的豐度以及熒光染料的亮度。常見的配色原則是將亮度高的染料配給低豐度的抗原或者低豐度細胞上的抗原。
熒光標記的抗體的可選擇性：從供應商處選擇流式驗證過的符合配色需求的抗體，如果無法找到合適的供應商，則可以考慮使用熒光二抗進行間接標記，但這種方案可能會造成種屬間的交叉反應以及高背景的問題。
如果研究人員無法在一次實驗中妥善調和上述因素，就需要退而求其次，進行多次分析。而多次分析難免引入各不相同的實驗條件，由此造成的數據波動最終會導致數據結果不可靠。
默克創新型多色流式分析解決方案
簡化多色流式分析流程
ColorWheel® 流式抗體和染料組合采用專為流式細胞術優化的專（禾刂）技術，支持用戶分別選擇抗體和染料并根據自身需要任意組合，在保證實驗成功率的同時又可幫助簡化流式細胞分析流程，突破傳統流式分析方案的局限。
主要優勢：
突破局限：可靈活選擇抗體和染料進行搭配組合，解鎖多色流式分析的無限可能。
簡化流程：簡單三步操作即可制備即用型抗體-染料溶液，實操時間不超過 5 分鐘。
高效穩定：單克隆抗體兼備高特異性和可重復性，凍干粉形式增強運輸和儲存穩定性。
潔凈兼容：無防腐劑，兼容的樣品類型更廣。
ColorWheel® 技術基于專（禾刂）的寡核苷酸配對連接技術將抗體與染料偶聯起來（詳見圖 3），偶聯產物與熒光標記的直標抗體保持一致，可以直接用于流式的標記檢測。該技術的偶聯過程只需要簡單的 1:1 的混合，其偶聯過程比起傳統的抗體標記方法大大簡化。ColorWheel® 流式抗體的選擇靈活性能讓使用者更加靈活的設計多色方案，擺脫由于抗體熒光組合缺失導致的配色困境（詳見表 2）。
圖 3 ColorWheel 流式抗體偶聯技術示意
表 2 Colorwheel® 助力突破傳統多色流式分析的局限
傳統方法
傳統方法的局限
Colorwheel® 方案
標記一抗
同時需要目標抗體以及與儀器兼容的染料
支持任意ColorWheel® 抗體和染料的組合，操作更靈活
標記二抗
需要多次反復洗滌，存在交叉反應性問題
ColorWheel® 抗體和染料通過 3 步即可完成結合反應，盡可能降低復雜物種反應性和反復洗滌引起的抗體損失風險
標記試劑盒
耗費更多時間和成本，并導致數據波動
ColorWheel® 抗體和染料無需額外的標記試劑盒，既節省時間，又節省成本，并可規避標記步驟帶來的數據誤差
應用舉例：
ColorWheel® 不僅可以簡化流式細胞分析流程，突破傳統流式分析方案的局限，同時可以保證在多重指標的流式實驗中具有優異的表現。
以下實驗檢測了免疫 T 細胞檢測常用的指標 CD3，CD4，CD44，CD45RA，該 4 重指標的實驗用來評估 CD4+ 輔助型T細胞的激活狀態。結果顯示，ColorWheel® 流式抗體與傳統的流式抗體具有同樣優異的表現（詳見圖 4）。
圖 4 ColorWheel 流式抗體與傳統流式抗體的檢測效果比較（左邊是 ColorWheel® 結果，右邊是傳統數據）
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