氨甲喋呤抗性和DHFR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法

1. 克隆培養(yǎng)親代細(xì)胞形成生長(zhǎng)旺盛、基因型一致的細(xì)胞群體，用于篩選。

2. 用無菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀釋 MTX，臨床使用的包裝是濃度為 2.5 mg/ml 的溶液。

3. 在幾個(gè)相同的培養(yǎng)瓶中分別種 2.5×105 個(gè)細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的*培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)至 7.4，37°C 培養(yǎng) 5~7 天。

4. 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，如果培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)有一小部分細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，其余的一些細(xì)胞是變大的，附著在基質(zhì)層上的可能要死的細(xì)胞，選擇這種培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，換含有相同量 MTX 的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 如果需要，可以更換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng) 5~7 天，但是細(xì)胞必須始終處于 MTX 環(huán)境中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 2~10×106 個(gè)/瓶，將細(xì)胞以每瓶 2.5×105 個(gè)傳入新培養(yǎng)瓶，分別加人原濃度的 MTX 和 2~10 倍原濃度的 MTX 。

6. 5~7 天后觀察新傳代的和原來加入較高濃度 MTX 的細(xì)胞，更換培養(yǎng)基，選擇可用細(xì)胞，方法同前。

7. 每步傳代的細(xì)胞用逐步增高的藥物濃度持續(xù)篩選，直至獲得要求的耐藥水平。改變而獲得低到中等水平耐藥、DHFR 活性增加和（或）轉(zhuǎn)運(yùn)能力改變的中同倉鼠細(xì)胞需要 2~3 個(gè)月；對(duì)于中國(guó)倉鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或生長(zhǎng)快的人的細(xì)胞來說，獲得高水平耐藥性和酶過度產(chǎn)生的變異株需要 4~6 個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。

8. 定期凍存篩選中的細(xì)胞于液氮中。