免疫熒光技術-直接法

1. 標本經固定后，PBS洗滌3×3 分鐘；

2. 加熒光素標記的抗體，濕盒內37 ℃孵育50 分鐘；

3. PBS洗滌3×3 分鐘；

4. 0.1 %伊文氏蘭復染；

5. PBS洗3 次，蒸餾水洗2 次，每次3 分鐘，以除去NaCl結晶；

6. 緩沖甘油封片，鏡檢。

對實驗結果的觀察、判斷與分析是影響實驗結果的重要環節，判斷結果的好與壞、真與假需注意以下幾點。

1、必須設立對照染色（陰性或陽性對照），沒有對照染色的結果是沒有說服力的。

2、正確判斷真陰性和假陽性。

(1)了解抗原表達是否在特定部位，如VP陽性出現在神經元胞漿，Fos標記細胞胞核，若陽性產物不在抗原所在部位，通常認為是假陽性。

(2)對陰性結果，不能視為抗原不表達，應該參考他人的結果或進行相應的對照實驗，尋找原因，判斷是否為真陰性。

(3)在切片破損區域，出血壞死灶或刀痕等位置容易出現陽性表達，應鑒別分析。

(4)染色時間的掌控很關鍵，可以避免非特異著色或假陽性細胞。

3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結果，判斷的關鍵在于以下幾點。

(1)組織切片完整，結構清晰，說明灌注取材、脫水、制片過程中沒有問題。

(2)切片著色鮮艷，說明抗體種屬之間配伍沒有錯誤，染色步驟正常。

(3)陽性與陰性結果部位明確，說明所用抗體的特異性強。

4.切片例數、陽性產物數量統計、分析應符合統計學要求。