怎么提高電穿孔法轉(zhuǎn)染的效率？

電穿孔法難點在于提高電穿孔的效率。實驗操作者一般能從電轉(zhuǎn)儀廠家得到轉(zhuǎn)染的詳細(xì)方案和優(yōu)化指導(dǎo)。當(dāng)你需要自己優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率時，可以從以下方面進行：

1、外加電場的強度：電壓過低，細(xì)胞膜不能形成小孔，使得外源分子通過；電壓過高，細(xì)胞會受到不可逆損傷，以至于裂解。對于大部分哺乳細(xì)胞來說，電壓250～500V/cm是合適的。實驗操作者需要查詢資料，找到所需細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的合適電場強度。

這部分的操作建議通過逐級增加電壓來確定*佳轉(zhuǎn)染電場強度。

2、電脈沖時間的長短：一般電脈沖只進行1次。根據(jù)電轉(zhuǎn)儀的具體參數(shù)設(shè)置，不同儀器間差異較大。

3、溫度：細(xì)胞在室溫時電轉(zhuǎn)染，瞬時表達(dá)水平*高；對于高強度電轉(zhuǎn)，產(chǎn)生大量熱量的實驗來說，將細(xì)胞保持在0°C較好，但電轉(zhuǎn)染后需要室溫孵育一段時間。

4、DNA：線性DNA比環(huán)形DNA的轉(zhuǎn)染效率高，合適濃度是1～40μg/mL。使用質(zhì)粒時，需要提高質(zhì)粒的純度。

5、培養(yǎng)基：用緩沖鹽溶液（HEPES鹽緩沖液）懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，比使用含非離子物質(zhì)（甘露糖、蔗糖）的緩沖液高數(shù)倍。

6、細(xì)胞狀態(tài)：最好使用生長活躍、狀態(tài)健康、無污染、傳代次數(shù)低的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。