如何避免掉進做免疫組化時導致非特異性染色的八大坑？

全國江山一片紅，這可不是閱兵日的朋友圈，而是在做免疫組化啊！好好的一張片子染得臟臟的。一下子整個人都不好了。這里，總結出了導致非特異性染色的八個大坑，以及避免掉坑里的一些做法。皆是獨門絕技，不要眨眼咯！

1、抗體問題，真的是一分錢一分貨

一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。

2、抗體濃度過高/孵育時間過長 

一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體前應該多做預實驗，摸索出較為理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調好定時器，提醒自己及時終止反應，就會避免這個問題。

3、DAB 染色時間太長/變質 

DAB 的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB 的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB 要保存于避光干燥的地方，現用現配，臨用前才加入 H2O2。圖 1 就沖洗的有些晚了；圖 2 就是剛剛好，染色效果棒棒噠!

4、內源性酶和生物素 

內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：較為常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL） 加入底物液中，并保持 PH 值在 7.6-8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制；對于內源性過氧化物酶，可以用 0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于 25 μg/mL 親和素溶液中 15 分鐘，PBS 清洗 15 分鐘后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分鐘。

5、組織變干 

一下子染太多片子的時候，容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣 2 mm。然后用 PAP 筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣 3-4 mm。

6、浸泡時間過長 

切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。獨門秘技就是 4°C 冰箱。只要把容器放在 4°C 冰箱里，過夜*沒有問題。

7、清洗不充分 

清洗一定要充分。PBS 液一定要雙蒸水新配，用之前再次測 PH 值。緩沖液用 0.05 mol/L 的 Tris-HCL，0.15 mol/L 的 NaCl 即可。如果加一點去垢劑 Tween-20 就更好了。

8、封閉血清問題 

是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用 PBS 稀釋為 3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30 分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。再貢獻一個獨門絕招，直接用奶粉也可以。用 5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎么樣？簡單吧。 

免疫組織化學是個苦活臟活。步驟多，時間長，還要接觸有毒有害的物質。要是好好的一張 片子染出來都是全國江山一片紅，那才叫虧大發了。以上，介紹了一些心得體會，希望對大家有所幫助。