RNA Trizol 抽提步驟

PCR、qRT-PCR 最最初始，都離不開 RNA 的抽提，RNA 質量的好壞，直接影響到后續的反轉錄及 PCR 等過程。很多時候，小伙伴們明明跟著 Trizol 步驟一步一步來的，謹小慎微，不敢懈怠，但就是 RNA 抽提不過關。其實 Trizol 抽提 RNA 是個細活兒，小伙伴們根據自身的實戰經驗，做一下優化很有必要~ 

Trizol 標準抽提步驟（打勾勾的自然是要注意的地方）： 

1、將裂解后樣品或勻漿液室溫放置 5-10 min，使得核蛋白與核酸*分離。 

?樣品中如含有較多的蛋白質、多糖、脂肪或其他細胞外基質，可以 12,000  rpm 離心 10 min，移去漂浮的油脂，取上清。 

2、加入 0.2 ml 氯仿，劇烈振蕩 15 sec，室溫放置 3 min。12,000 rpm 4°C 離心 10 min。 

?如不能旋渦混勻，可手動顛倒混勻 2 min。 

?樣品會分成三層：上層水相，中間層和下層有機相。RNA 在上層水相中。 

3、吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置 20 min。 

?不要吸取任何中間層物質，否則會出現染色體 DNA 污染。 

4、12,000rpm 4°C 離心 10 min，棄上清。

?離心前 RNA 沉淀通常是不可見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。 

5、加入 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀。12,000 rpm 4°C 離心 3 min，棄上清。室溫干燥 5-10 min。 

?75%乙醇用 DEPC 處理過的水配制。 

?通常 1 ml Total RNA Extractor 需用 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀。 

?不要倒出沉淀，剩余少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，不要吸沉淀。 

?不要晾的過干，RNA *干燥后很難溶解，大約晾干 5 min 左右。 

6、加入 30-50 µl RNase-free ddH2O，充分溶解 RNA。將所得到的 RNA 溶液置于 -70°C 保存或用于后續試驗。 

?對于肝、胰腺、腎等組織中 RNase 含量很高，沉淀用 100%去離子甲酰胺溶解。

額外的小 TIP~（第三步）： 

很多剛開始學抽提的小伙伴吸取上層水相總是吸到中間層物質。既然吸上層手容易抖，那不妨吸下層遺棄然后把剩余的再進行離心。這樣多一步，離完心剩下的基本就是上層水相和中間層沉淀，再吸取想要的目標就能輕松改掉手抖啦～ 

Protocal 改善的地方~(還是第三步)：

3、吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入 2.5 倍體積乙醇，1/10 倍體積 3M 醋酸鈉，以及糖原。混勻，-80°C 放置 30-60min。

?不要吸取任何中間層物質，否則會出現染色體 DNA 污染。 

?加入糖原，使溶液中糖原的最終濃度達到 50ng/µl。 

?混勻后，-80°C 放置 30 -60min，適當增長孵育時間或者降低孵育溫度將有助于小 RNA 的沉降。 

?以取 500µl 上層水相為例，則需加入 1250µl 乙醇，50µl 醋酸鈉以及 4.5µl 糖原原液（原液濃度為：20mg/ml）。